Mikrobiologická syntéza vitaminu B12

Vitamin B12 je ve vodě rozpustný vitamin skupiny B. Na rozdíl od jiných látek této skupiny se může akumulovat v lidském těle, především v játrech, slezině, plících a ledvinách. Absorbuje se v tenkém střevě a usazuje se v játrech.

Jako součást obsahuje i ion kobaltu, tedy další jméno - kyanokobalamin nebo kobalamin. Cyankobalamin je odolný vůči světlu a vysokým teplotám a je lépe konzervován v potravinách při tepelném ošetření.

Obsah vitaminu B12 v produktech

Aktivita kyanokobalaminu je velmi vysoká a množství vitaminu B12 v potravinách se měří v mikrogramu. Proto je potřeba člověka malá.

Množství vitaminu B12 ve výrobcích (μg / 100 g):

  • Hovězí játra - 60;
  • Srdce - 25;
  • Ústřice - 18;
  • Pstruh - 7,5;
  • Sleď - 13;
  • Ruský sýr - 1,5;
  • Sardinky v oleji - 8,5;
  • Králičí maso - 4,3;
  • Hovězí maso 3,0;
  • Ostružina - 2,4;
  • Cod - 1,6;
  • Holandské sýry - 1,1;
  • Sýr Poshekhonsky - 1,4;
  • Tvarohový sýr - 1,0;
  • Kuřecí vejce - 0,5;
  • Kravské mléko - 0,4;
  • Kefír - 0,4;
  • Máslo - 0,1.

Hlavním zdrojem tohoto vitamínu pro tělo jsou živočišné produkty. Některý kobalamin je syntetizován ve střevě vlastní mikroflórou. Velmi malé množství se vyskytuje u sójových bobů, chmele, špiček, špenátu, zeleného salátu.

Vitamín B12 Spotřeba

Věk definuje každodenní potřebu kyanokobalaminu. U dětí ve věku do 6 měsíců činí 0,4 μg / den, u dětí od 6 do 12 měsíců - 0,5 μg / den, od 1 do 3 let, tato potřeba se zvyšuje na 1 μg / den, od 4 do 6 let - až 1,5 mcg / den. Děti ve věku 7-10 let vyžadují 2 μg vitaminu denně, adolescenty ve věku 11-17 let a dospělé - 3 μg / den. U těhotných a kojících žen je potřeba vyšší - 4 mcg / den.

Existuje další označení množství vitaminu B12 - v mezinárodních jednotkách (IU). 1ME odpovídá účinnosti 1 μg kyanokobalaminu.

Metabolismus kobalaminu v těle je velmi pomalý a pro jeho nedostatek trvá nejméně 5-6 let. Pokud osoba užívá přípravky obsahující draslík, vzniká několikrát rychlejší hypovitaminóza.

Pokud člověk kouří, konzumuje alkohol nebo je vegetarián, pak se zvyšuje potřeba vitamínu B12.

Při nadměrné spotřebě sladkých, sycených nápojů a chronických průjmů dochází ke zhoršení absorpce cyanokobalaminu ze střeva a snižuje se tak jeho příjem.

Pokud člověk používá mnoho různých léků, a zejména antikoncepce, zvyšuje se spotřeba kyanokobalaminu.

Hodnota vitamínu B12 v těle

Vitamín B12 hraje významnou roli v biologických procesech těla, spolu s dalšími vitamíny se podílí na metabolismu tuků, bílkovin a sacharidů, stejně jako:

  • Podílí se na tvorbě červených krvinek - červených krvinek;
  • Pomáhá odstraňovat homocystein z těla - aminokyselinu, která přispívá k výskytu mrtvice a infarktu myokardu;
  • Snižuje množství tuku a cholesterolu v těle;
  • Zlepšuje dostupnost kyslíku v buňkách během hypoxie;
  • Podílí se na regeneraci poškozených tkání, účastnících se syntézy nukleových kyselin;
  • Podporuje tvorbu aktivních forem vitamínu A;
  • Podílí se na tvorbě hormonu melatoninu, který reguluje biorytmy;
  • Má vliv na reprodukční systém mužů - zvyšuje obsah spermií v pohlavních žlázách;
  • Reguluje imunitní systém;
  • Je to katalyzátor pro biochemické transformace organických kyselin, v důsledku čehož vzniká myelin - plášť nervových vláken.

Vitamín B12 je velmi důležitý pro vlasy, pro jejich růst a zdravý vzhled.

Nedostatek vitaminu B12

Hypovitaminóza se vytváří při nedostatečném příjmu cyanokobalaminu spolu s jídlem, porušení jeho absorpce při užívání určitých léků. Známky selhání jsou následující příznaky:

  • Nízký počet hemoglobinů, počet destiček a leukocytů;
  • Narušení trávicího systému;
  • Únava, podrážděnost, deprese;
  • Pocit necitlivosti a obtížnosti chůze;
  • Stomatitida, glositida;
  • Bolesti hlavy;
  • Rozmazané vidění;
  • Bolestná menstruace.

Nedostatek vitaminu B12 pro vlasy vede ke ztrátě vlasů a časnému šednutí.

Přebytek vitaminu B12

Hypervitaminóza kyanokobalaminu se vzácně vytváří, při nedodržení dávky při podávání tablet s vitamínem B12 nebo při parenterálním podání.

Hlavní příznaky předávkování:

  • Plicní edém;
  • Venózní trombóza;
  • Urtikárie nebo anafylaktický šok;
  • Srdeční selhání.

Použití kyanokobalaminu pro terapeutické účely

Jako lék se používá vitamin B12 v ampulích nebo tabletách pro onemocnění, jako je hepatitida, anémie, ischiatika, polyneuritida, chronická pankreatitida, roztroušená skleróza, diabetická neuropatie, ozařovací nemoc, mozková obrna, poranění periferních nervů, kožní a alergické onemocnění.

Tablety vitaminu B12 jsou lépe absorbovány při užívání kyseliny listové. Používá se při léčbě anémie v dávce 30 až 200 mg denně každý druhý den až do dosažení remise.

Vitamín B12 v ampulích se používá k intravenóznímu, intramuskulárnímu, intra-lumbálnímu a subkutánnímu podání.

V případě neurologické patologie, včetně bolestivého syndromu, je vitamin B12 podáván od 0,2 do 0,5 mg na injekci v inkrementálním vzorku, 1 krát za 2 dny, po dobu až 2 týdnů.

Kontraindikace

Nepoužívejte vitamín B12 v ampulích a tabletách v případě tromboembolie, erytrocytózy a individuální intolerance. Současná angina pectoris vyžaduje opatrnost.

Získání vitamínu B12

Získání vitaminu b 12 pomocí bakterií kyseliny propionové

V současné době získáváte vitamín b 12 Používají se následující mikroorganismy Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 a jejich varianty a mutanty. Největším zájmem jsou kmeny schopné samostatné syntézy 5,6 DMB. Vzhledem k tomu, že syntéza 5,6 DMB nastane lépe s přístupem vzduchu, provádí se dvoustupňový proces, ve kterém je dosažen nejvyšší výtěžek produktu. Ve stádiu 1 se kultura pěstuje za anaerobních podmínek až do úplného využití cukru. V 2. etapě je zahrnuto aerace, čímž se vytváří podmínky pro syntézu 5,6 DMB a přeměnu ethiobaloamny na desoxykobalamin. Obě etapy se provádějí ve dvou různých fermentorech nebo v jednom. Anaerobně rostoucí buňky mohou být sklizeny centrifugací a hustá suspenze je inkubována ve vzduchu a v případě potřeby za přítomnosti 5,6 DMB a kyanidu. Přidání DMB se produkuje pouze v 2. etapě fermentace (jestliže bakterie ji nekombinují nezávisle), neboť v přítomnosti se tvoří kompletní formy vitaminu, které inhibují jeho syntézu. Fermentační médium obvykle obsahuje glukózu nebo invertovanou melasu (10-100 g / l), malé množství solí Fe, Mn a Mg, stejně jako Co (10-100 mg / l), zdroje dusíku. Ve středu přidejte kukuřičný extrakt (30 - 70 g / l), obsahující kyselinu mléčnou a kyselinu pantothenovou, což zvyšuje růst bakterií. Do média se doporučuje přidat kyselinu pantothenovou, která rovněž stimuluje syntézu vitaminu. Bakterie se kultivují při 30 ° C, přičemž pH se udržuje na hodnotě 6,5 až 7,0 zavedením (NH4) OH. Fermentace se provádí ve fermentorech na 500 litrů obsahujících 340 litrů média očkovaného 7 l semena. V prvních 80 hodinách kultura roste pod mírným tlakem N2 a slabým mícháním (bez aerace), v příštích 88 hodinách zahrnuje aerace (2 m3 / h) a míchání. Existují určité rozdíly v kultivaci. Vitamin B12 je uložen v buňkách bakterií, takže je extrahován:

1) uvolnění vitamínu z buněk a jeho přeměnou na kyanokobalamin;

2) izolace surového produktu (čistota 80%), která může být použita při chovu zvířat;

3) další čištění na úroveň 91-98% (pro lékařské účely).

K extrakci vitaminu z buněk se tyto buňky zahřívají při 80 až 120 ° C po dobu 10 až 30 minut při pH 6,1 až 8,5. Konverze na CN-kobalamin se dosáhne zpracováním horkého roztoku nebo buněčné suspenze kyanidem nebo thiokyanátem, často v přítomnosti NaN02 nebo chloraminu B. Korrinoidy jsou sorbovány na různých nosičích: amberlit IRC-50, A1203, aktivním uhlí a eluovány vodnými alkoholy nebo směsmi vody a fenolů. Vitamín B12 se vytváří ve významných množstvích pomocí acetogenní Clostridia Cl. termoacetikum, Cl. pro - micoaceticum a Acetobacter ivoodi. Korrinoidy jsou extrahovány z vodných roztoků fenolem nebo kresolem nebo směsmi těchto alkoholů s benzinem, butanolem, chloridem uhličitým nebo chloroformem. Odpařením různých rozpouštědel se získá sraženina nebo krystaly vitaminu, které se rozpustí ve vhodném rozpouštědle na požadovanou koncentraci. Přirozené kmeny bakterií kyseliny propionové tvoří 1,0 až 8,5 mg / l corrinoidů, ale získává se mutant P. shermanii M-82, kterým je možno získat až 58 mg / l vitaminu.

Existuje však patentová zpráva (Francie) o dosažení neuvěřitelně vysokého výtěžku - 216 mg / l.

V rodině Propionibacberiaceae existují i ​​další zástupci, schopní vysoké akumulace vitaminu B12 v buňkách. Jedná se především o Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Mnozí zástupci aktinomycétů a příbuzných mikroorganismů mají praktický význam jako výrobci vitaminů. Pravý vitamín B12 ve významných množstvích syntetizuje Nocardia rugosa. Mutací a selekcí získaného kmene N. gigosa, který hromadí až 18 mg / l vitaminu b12. Aktivními producenty vitaminu se vyskytují mezi členy rodu Micro-monospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica.M. fúzované, M. chalceae. Metanogenní bakterie, například Methanosarcina barkeri, M. vacuolata a některé kmeny halofilních druhů Methanococcus halophilus, mají vysokou aktivitu pro syntézu kobalaminů. Posledně jmenovaný organismus syntetizuje více než 16 mg corrinoidů na gram biomasy. Takový vysoký obsah korrinoidů nebyl pozorován u žádného jiného studovaného mikroorganismu. Důvod pro vysoký obsah korrinoidů u methanogenních bakterií nebyl stanoven.

Získání vitamínu B12 pomocí bakterií Pseudomonas denitrificans

Řada kmenů rodu Pseudomonas tvoří významná množství B12, ale nejčastěji používaným mutantem je Ps. denitriflcans, které v důsledku mutagenese zvyšují hladinu vitaminu B12 podařilo se zvýšit z 0,6 mg / l (divoké kmenové) na 60 mg / l. Bakterie se kultivují provzdušněním a mícháním v pravidelných (nebo průtokových) podmínkách v médiu (a) následujícího složení: cukrová řepa melasa 100 g, kvasničný extrakt 2 g, (NHtbHP04- 5 g, MgS04-3 g, MnS04- 200 mg, CoNo3 - 188 mg, 5,6 DMB - 25 mg, ZnS04 - 20 mg, Na2MoO3 - 5 mg, voda z vodovodu - do 1 l, pH 7,4 Melasa je bohatá na betain a kyselinu glutamovou, které mají pozitivní vliv na výtěžek vitaminu B. Betain stimuluje syntézu b-ALA a případně také mění permeabilitu membrány. Kultura se udržuje v lyofilizovaném stavu, udržovaný ve výše uvedeném Složení média (b): cukrová řepková melasa - 60 g, pivovarské kvasnice - 1 g, NZ-amin - 1 g, (MN4BH4 - 2 g, MgS04 - 1 g, MnSO4 - 200 mg, ZnS04 - 20 mg, MoSO4 - 5 mg, agar - 25 g, voda z vodovodu - až 1 l, pH 7,4, inkubovány 4 dny při 28 ° C. Buňky se pak přenesou do 150 ml kapalného média stejného složení. (ale bez agaru), nalije se do litrové Erlenmeyerovy baňky. Inkubujte po dobu 3 dnů při 28 ° na houpací židli. Obsah baňky se zavede do 5 1 fermentoru obsahujícího 3,3 litru média (viz výše), sterilizuje se 75 minut při 120 ° C. Inkubujte po dobu 90 hodin při teplotě 29 ° C za míchání (420 otáček za minutu) a provzdušňování (0,2 m3 / h). Čistý vitamin B12 v důsledku následujících následných operací:

Kultivační tekutina s buňkami Ps. denitrificany (3,3 1) zahříváním 30 minut při 20 ° C, ochlazením, úpravou pH na 8,5, přidáním KCN, mícháním po dobu 16 hodin při 25 ° C, přidáním 200 ml chloridu zinečnatého, úpravou pH na 8,0, mícháním, filtrací.

· Trojnásobná extrakce 350 ml směsí

· Kresol a tetrachlormethan (poměr 1: 2)

· Organický extrakt I

· Trojnásobná extrakce 30 ml. směsi krezolu a

· Chlorid uhličitý (poměr 1: 2)

· Organický extrakt II

· Přidání 200 ml acetonu a 120 ml etheru

· Surový vitamín B12

Výsledkem extrakce je získání kyanokobalaminu s čistotou 98% a výtěžkem 75%. Konečný výtěžek je 59-60 mg / l, CN-kobalamin je stabilní forma vitaminu.

Získání vitamínu B12 za použití kmene bakterie Pseudomonas fluorescens BKM B-2224D

Mikrobiologický průmysl Oblast techniky Vynález se týká mikrobiologického průmyslu a týká se nového kmene bakterií Pseudomonas fluorescens BKM B-2224D, které produkují vitamín B12, který je používán jako antianemikum v medicíně a ve výrobě doplňkových látek pro hospodářská zvířata a drůbež.

Cílem vynálezu je získat kmen bakterií, které mohou syntetizovat vitamin b12 ve vyšší koncentraci než známé mikrobiální výrobce.

Podmínky pro biosyntézu vitaminu b12 kmen Pseudomonas fluorescens BKM B-2224D.

Biosyntéza vitaminu B12 kultura Pseudomonas fluorescens BKM B-2224D se provádí podle následujícího schématu: sejba na agarovém médiu -> výsev kultivace na baňkách na kapalném médiu - - kultivace na kapalném médiu v secím zařízení - -> biosyntéza na kapalném médiu ve fermentoru.

V baňce s třepáním o objemu 750 ml s objemem 50 ml se kultura zavádí ze zkumavky v množství 0,1%.

Pěstovala se kultura při teplotě 30 ° C po dobu 48 hodin.

Podmínky fermentace: konstantní míchání, teplota 28-32 ° C, s přívodem vzduchu 02-05 l / l média za minutu po dobu 40-60 hodin na optickou hustotu větší než 0,2.

Výsledný inokul v dávce inokulovaného sterilního fermentačního média.

Fermentace se provádí při teplotě kultivační tekutiny 28 až 32 ° C za stálého míchání a přetlaku 0,5 MPa s průtokem vzduchu 0,2 l / l média za minutu.

Kultura Pseudomonas fluorescens BKM - 2224D se vyznačuje skutečností, že její růst probíhá paralelně s biosyntézou vitaminu B12 v aerobních podmínkách během fermentačního procesu.

Obsah vitaminu B12v kultivační tekutině ke konci fermentace je 120-150 ug / ml, pokud je stanovena mikrobiologickou metodou za použití E. 113-3-3 jako testovací kultury nebo spektrofotometrickou metodou. Když se kultivují bakterie kyseliny propionové, obsah vitaminu B12 v kultivační tekutině je 40 až 50 ug / ml.

Na konci fermentačního procesu se kultivační tekutina okyselí kyselinou sírovou na pH 5,8 jednotek, kultura se lýzuje při teplotě 90 až 10 ° C. K získání konečného produktu může být kultivační tekutina zpracována v rozprašovací sušárně s plnivy (křída, sůl, otruby a ostatní) nebo posláni do přijímacích a vylučovacích stádií vitamínu B12 ve své nejčistší podobě.

Získání vitaminu B12 s metanogenními bakteriemi

V buňkách bakterií produkujících metan, vitamín B12 od 4,1 nmol / mg suchých buněk v Methanosarcina barkeri do 0,65 nanomoles / mg suchých buněk v Metanobacterium formicum. Biosyntéza kobalaminů archaebakteriemi (studovaná u M. barkei) je podobná biosyntéze korinotinů v anaerobních eubakteriích. V metanotrofu Mtb. thermoautotrophicum Velká část buněčného kobamidu je lokalizována v membránové frakci a je spojena s membránovým proteinem. Předpokládá se, že integrální membránový proteinový komplex obsahující kobamid hraje významnou roli v metabolismu těchto bakterií při využití H2 + C02, což se zřejmě sníží na přenos elektronů. Korrinoidy v metanotvorných bakteriích se také podílejí na katabolismu acetátu a methanolu. Převedení methanolu na metan v Mis. barkeri dochází vytvářením CH3-CoM, jehož metylace způsobená methanolem zahrnuje dvě methyltransferázy, v závislosti na kobamidu. Zdá se, že corrinoid je protetickou skupinou enzymu. Ve Francii byly mezofilní metanogenní bakterie izolovány z kalů z odpadních vod a inkubovány v kombinaci s jinými bakteriemi v polořadovkovém režimu v médiu obsahujícím methanol (3-12 g / l), melasu, kukuřičný extrakt, NH4, Co, ortoxylidin a 5,6 DMB. Fermentace se provádí při teplotě 35 ° ve fermentoru na 1000 m3 při denním nahrazení 10% fermentačního substrátu čerstvým médiem. Biomasa se oddělí v separátorech a suší se v rozprašovací sušárně. Vysušený koncentrát je zprůměrován křídou ke standardní aktivitě 1000 μg / g přípravku, který se v této formě používá jako přísada pro krmení. Suchý koncentrát před průměrem obsahuje - 3000 mcg / g vitaminu B12, což je 45-50% z množství kortizinoidů, faktor III - 10-15% a ostatní neúplné korinožce - 40-50%. Termofilní kmeny methanotrofních bakterií rodu Methanobacillus a Methanobacterium tvoří 2 mg / l kobalaminu, je-li obsah v médiu 8 g / l methanolu. V Rusku je produkce krmiva pro vitamin B12 založena hlavně na zpracování bard (odpad z acetonu-butyl nebo alkoholu) biocenózou bakterií zabývajících se termofilním fermentací odpadních vod metanem. Využívá se komplexní konsorcium anaerobních mikroorganismů, které zahrnují karbohydrátové stříkající, ammonifikační, sulfátové a metanotvorné bakterie. Metanol se přidává do bard až do 2%, CoCl2-6H2O - 10 g / m3, močovina - 300 g / m3 a suché krmné kvasnice - 230 g / m3. Dávkování přípravků se vyrábí automaticky. Bard se přivádí do spodní části fermentoru digestru (4-5 tis. M3 pas), v němž jsou procesní parametry automaticky řízeny, což zajišťuje kontrolu teploty (55-57 ° C), pH (7,5-8,0) a dobu fermentace. Fermentace probíhá nepřetržitě a denně nahrazuje 20-25% fermentační kapaliny čerstvým bardem. Jako odpěňovač používejte rybí olej. K přípravě krmiva se kašovitá směs odpaří a vysuší. Vzhledem k tomu, že při tepelném ošetření je vitamin B12 nestabilní, zejména v alkalickém prostředí, je stabilizován. Za tím účelem se kapalina získaná při fermentačním procesu před odpařením okyselí na pH 5,0 až 5,3 a k ní se přidá siřičitan sodný (0,1 až 0,25%). Obsah vitaminu B12 v počáteční fermentované kapalině činí 4,4 g / m3. Kondenzace fermentovaných bard se provádí na výparnících (až 14-17% obsahu sušiny) a suší se v rozprašovací sušárně. Koncentrace vitaminu B12 v sušeném produktu činí 500-600 mg / kg. Pravý vitamín činí 20-25% z množství kortizinoidů, faktor III - 35-40%, faktor B a další - 40-45%. Výsledná lék se nazývá KMB-12.

Schéma je znázorněno na obr. 5. Aceton-butylbard ze spodku kolony kolony vstupuje do kolekce 1 a je čerpán do dekantéru 3. Kaly z kalu jsou shromažďovány v sběru 4 a používány jako krmivo pro zvířata. Po dekantování, ochlazené na teplotu 55-57 ° C, vstoupí do fermentoru 12 methanol a chlorid kobaltnatý. Fermentovaná hmota z horní části fermentoru se odebírá a zavádí do reaktoru 19, kde stabilizuje vitamin B12 přídavkem siřičitanu sodného a kyseliny chlorovodíkové ve směsi v mixéru 18. Z stabilizovaných mash odstraní plynů v plynové separátoru 22, rmut se zahustí v odpařovacím zařízení 24 a jsou shromažďovány ve sběrném 26. koagulované metanu kaše se čerpá 27 do sběrného metanu rmutu 28 a odtud na čerpadlo 29 do rozprašovací sušičky 31.

Jako tepelný nosič pro sušení se používají fermentační plyny, které jsou spáleny v peci 39. Suchý prášek vstupuje do násypky 33 a je zabalen do plastových sáčků uzavřených v Kraftových pytlích.

Absence průmyslových odpadů, dostupnost surovin, kontinuita metody, která nevyžaduje sterilní podmínky, činí to ekonomickou.

Krmte vitamín b12 přijmout v Sovětském svazu biochemické rostliny Grozny aceton a Efremov. Pro výrobu vitamínu B12 Byly zavedeny a nedávno zavedeny automatizační systémy hlavních etap technologického procesu.

Suchý koncentrát KMB-12, kromě vitamínu B12 (100 mg / kg léčiva), obsahuje řadu dalších látek stimulujících růst. Zvláště dobré výsledky při chovu zvířat se dosahují kombinací vitaminu B12 s malými dávkami antibiotik, zejména s biomycinem. Realizace popisované metody v naší zemi a získání koncentrátu vitaminu B12 dovolit plné zásobování zvířaty tímto vitamínem.

V USA je téměř veškerý krmivo pro prasata a drůbež obohacen o vitamín B12. Bylo prokázáno, že živočišná bílkovina může být nahrazena rostlinnými bílkovinami za předpokladu, že krmné směsi jsou obohaceny o vitaminy B12 v dávce 60 μg / kg.

Obrázek 5 - Technologický schéma získání koncentrátu vitaminu B12 pomocí směsné kultury bakterií tvořících metan: 1 - sbírka bordů; 2 - čerpadlo pro bary; 3 - bard dekantér; 4 - sbírka kondenzovaných bordů; 5 - sbírka bordů; 6 - čerpadlo pro dekantaci bardů; 7 - lednička pro chlazení dekantace bardů; 8 - sběrná směs methanolu; 9 - dávkovací čerpadlo methanolu; 10 - roztok chloridu kobaltnatého; 11 - dávkovací čerpadlo z roztoku chloridu kobaltnatého; 12 - fermentor pro fermentaci metanu; 13 - čerpadlo pro přípravu metanu; 14 - sbírka-mernka kyselina chlorovodíková; 15 - dávkovací čerpadlo kyselina chlorovodíková; 16 - roztok sirníku sodného; 17 - dávkovací čerpadlo roztoku siřičitanu sodného; 18 - směšovač methanové kaše, roztok kyseliny chlorovodíkové a siřičitanu sodného, ​​19 - reaktor pro stabilizaci vitamínu Bi2 v metanové kaši; 20 - čerpadlo pro stabilizovaný přívod metanu; 21 - stabilizovaný ohřívač metanu; 22 - separační plyny uvolněné z metanu; 23 - čerpadlo pro dodávání stabilizované metanové varny do jednotky výparníku; 24 - ohřívače metanu; 25 - odpařovací zařízení pro koncentraci metanové kaše (těleso a-1, těleso 6-II, tělo s-III, těleso d-IV, d-barometrický kondenzátor, e-vakuové čerpadlo); 26 - sbírka kondenzovaného metanu; 27-čerpadlo pro kondenzovaný metanový vařič; 28 - sběr kondenzovaného metanu (přenos); 29 - čerpadlo pro kondenzovaný přívod metanu; 30 - ohřívač kondenzovaného metanu; 31 - odstředivá sprejová sušička; 32 - cyklóny rozprašovací sušárny; 33 - zásobník suchého koncentrátu; 34 - balení v pytlích; 35 - pračka pro čištění kouřových plynů ze sušičky z koncentrovaného prášku; 36 - zařízení pro katalytické spalování plynů uvolněných během okyselování a zahřívání metanové kaše; 37 - plynová nádrž pro fermentační plyny; 38 - lednička pro oddělování vody od fermentačních plynů; 39 - sušárna s plynovou pecí.

Ukrajinský Výzkumný ústav alkoholických a likérových a vodárenských průmyslových odvětví vyvinul technologii pro získání koncentrátu vitaminu B.12 fermentací melasy alkoholových bardů se smíšenou kulturou bakterií tvořících metan. Krmné kvasinky se předběžně pěstují na melasovém alkoholu bard. Po oddělení kvasinek se získá kultivační tekutina obsahující 7-8% pevných látek. Methanotvorné baktérie se na této kapalině pěstují a získá se 1,5-2 g vitaminu B z 1 m 1 původních bard12.

Kultivační kapalina se odpaří na obsah 60 až 70% pevných látek, smísí se s plnivem a vysuší. Kukuřičná mouka, otruby apod. Se používají jako plnidla. Suchý koncentrát se rozemele a balí v pytlích. 1 kg koncentrátu obsahuje: vitamín B12 18 - 20 mg, B2 41 mg, PP 146 mg a další vitamíny. Doba použitelnosti je 12 měsíců.

Mezofilní a termofilní metanogenní bakterie, včetně Metanobacterium thermoautotrophi-site, Mb. termoformicinu, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, paní vacuolata, p. mazei, Methanococcus hatopilus, syntetizuje výlučně faktor III. Pravý vitamín B12 vytvářejí non-sporotvorné methylotrofy: Eubacterium limosum, v jeho blízkosti jsou Butyribacterium methylotrophicum a Acetobacter woodi. Vytvářením umělých biocenosů a výběrem fermentačních podmínek je možná účelná regulace biosyntézy vitaminu B.12. Nový vývoj. Snížit produkci vitaminu B12 a využití levných obnovitelných surovin byl studován růst na xylóze jako hlavní složka hydrolyzátů hemicelulózy. Byla studována tvorba korrinoidů bakterií Prop, atidipropionici ATCC 25562. Při použití xylózy bakterie nahromadily 0,35 mg kortizidů v jednom litru média bez přídavku solí. Pro výrobu korrinoidů z xylózy je nejvhodnější reaktor UFR pracující s recyklací ultrafiltračních článků. Imobilizované buňky v Japonsku zaměňují stabilitu a produktivitu biokatalyzátoru se zahrnutím buněk Propionibacterium sp. v kappa-karagenanu, Na-alginátu, agaru a prepolymerových urethanových gelech. Optimálním substrátem je předpolymer PU-9, jehož polymerní matrice nezmenšuje aktivitu buněk, které jsou v něm obsaženy. Za optimálních podmínek fermentace bylo nově syntetizováno 5 g imobilizovaných buněk a 900 μg vitaminu bylo vyloučeno po 18 dnech opakované periodické fermentace, což demonstrovalo možnost provedení vícestupňové komplexní syntézy (některé z těchto příkladů jsou známé). Zlepšení kmenů producentů. V posledních letech bylo zlepšení kmenů dosaženo prostřednictvím mutací a výběru. Tato metoda zvyšuje produktivitu vitamínů Ps o 50krát. denitrificans. U gram-pozitivních baktérií je použitelné Propionibacterium, Bacillus, Streptotnyces, fúze protoplastů, pro gramnegativní bakterie, například Pseudomonas, jsou k dispozici konjugační plazmidy. Doposud nebyly s těmito novými a výkonnými metodami dosaženy žádné významné praktické výsledky, ale počátkem takové práce bylo dosaženo. Klonovalo 11 genů kódujících enzymy biosyntézy vitaminu B12 mít bakterie vy. megaterium. Předpokládá se, že genom obsahuje pouze 20-30 takových genů. Proto jste DNA. megaterium byl fragmentován a velké fragmenty byly vloženy do plazmidů, které byly dále transformovány mutanty-auxotrofy v B12. Takové mutanty získaly schopnost syntetizovat vitamin B12. Metoda může být použita k výrobě kmenových výrobců v průmyslovém měřítku. V bakteriích E. coll jsou klony prop a technicum, které jsou odpovědné za syntézu vitaminu B.12. Bakterie Prop. technicum neobsahuje plazmidy, takže byla izolována, purifikována a částečně zničena DNA z tohoto kmene, což vedlo k fragmentům 15-20 kilobází. Tyto fragmenty byly vloženy do štěpeného plazmidu pBR 322 a výsledný hybridní plasmid byl transformován do E. coli. Nové transformanty se lišily od kontrolního kmene z hlediska morfologických a fyziologických znaků.

Produkce vitaminu B12

Posted on Sat, 3/26/2011 - 16:30 admin

Vitaminy - skupina organických látek s nízkou molekulovou hmotností, která mají ve velmi nízkých koncentracích silný a různorodý biologický účinek. V přírodě jsou zdrojem vitamínů především rostliny a mikroorganismy. Menachinony a kobalaminy jsou syntetizovány výlučně mikroorganismy. Přestože chemická syntéza zaujímá vedoucí pozici při výrobě většiny vitaminů, mikrobiologické metody mají také velkou praktickou důležitost [1,2].

Principy chemické struktury vitaminů jsou tak rozmanité, že jejich klasifikace na základě struktury je nemožná. Vitamíny jsou rozděleny podle principu rozpustnosti na liposolu a ve vodě rozpustné. Z vitamínů rozpustných v tucích jsou vitaminy A a D nejdůležitější v národním hospodářství av mikrobiologickém průmyslu a ve vodě rozpustných vitamínů B2 a B12 [1,4]. Kromě toho se mikroorganismy používají jako selektivní oxidační činidla sorbitolu na sorbosu (po obdržení vitamínu C), stejně jako pro výrobu vitaminových koncentrátů (vitamín B2, karotenoidy). Mikrobiologická produkce biotinu používaného ve stravě kuřat a prasat je slibná. V současné době na Západě obsahuje většina krmiv pro prasata biotin, který se vyrábí chemickou syntézou. Výsledkem chemické syntézy je tvorba racemické směsi, která má biologickou aktivitu pouze formu D vitaminu, který je syntetizován mikroorganismy [1].

Vitamin B12

Mezi nepolymerní sloučeniny patří vitamin B12 má nejsložitější strukturu. Jedná se o α (5,6-dimethylbenzimidazol) kyanamid kyanid:

V molekule vitaminu B12 rozlišujte:

1. Porfyrinový, chromoforový nebo korrinový kruh, navázaný na atom kobaltu čtyřmi koordinačními vazbami přes atomy dusíku.

2. Horní koordinační ligand kobaltu ve vitamínu B12 je kyanoskupina. Mohou nahradit i jiné anorganické nebo organické substituenty, jako je NO.2 2-, SO2 2-, OH-, H2O, CH3, adenosyl; substituenty určují název derivátů vitaminu B12.

3. Šestá pozice kobaltu je obsazena nukleotidovým jádrem (nižším ligandem kobaltu) sestávajícím z dusíkové báze, ribózy a zbytku kyseliny fosforečné. Nukleotidové jádro je spojeno s kobaltem dusíkem dna a korrinovým kruhem přes aminopropanolový můstek.

Vitamin B12 nebo dusíkovou bázi kyanokobalaminu představuje 5,6-dimethylbenzimidazol (5,6-DMB). Přítomnost 5,6-DMB určuje aktivitu molekuly corrinoidů (synonyma s názvem vitamínů skupiny B12) u vyšších zvířat. Místo 5,6-DMB mohou mikroorganismy v molekule obsahovat další benzimidazolové a purinové báze. Nukleotidové jádro může být úplně chybějící, jako v případě faktoru B.

25 let po objevení vitamínu B12 V roce 1972, v důsledku dlouholetého výzkumu, byla provedena kompletní chemická syntéza korrinoidní struktury. Corrinoid byl syntetizován jako výsledek třiceti sedmi po sobě jdoucích kroků, ale kvůli složitosti takové syntézy je mikrobiologická metoda stále jedinou průmyslovou metodou pro získání vitaminu B12 [1].

Výrobci vitaminu B12

V přírodě je vitamin B12 a příbuzné korrinoidní sloučeniny se nacházejí v buňkách mikroorganismů, v tkáních zvířat a některých vyšších rostlinách (hrach, lotos, bambusové výhonky, listy a fazolové struky). Nicméně původ vitaminu B12 ve vyšších rostlinách není konečně stanovena. Takové nižší eukaryoty jako kvasnice a filamentózní houby, korrinoidy, se zjevně netvoří. Zvířecí tělo není schopné samo-syntézy vitamínu. Schopnost biosyntézy korrinoidů je rozšířena mezi prokaryoty. Aktivně produkujte vitamin b12 Zástupci rodu Propionibacterium [1, 4, 5] bakterií kyseliny propionové kmeny.Prirodnye, tvoří 1,0-8,5 mg / l corrinoids, ale získaná mutantní R. shermaniiM 82, přes kterou se obdrží 58 mg / l vitaminu [1 5]. V rodině Propioni bacberiaceae existují i ​​další zástupci, schopní vysokou akumulaci vitaminu B12v buňkách. Jedná se zejména o Eubacterium limosum Butyribacterium rettgerii). Jako producent vitamínů je praktickým zájmem řada zástupců aktinomycetů a příbuzných mikroorganismů [1, 4]. Pravý vitamín B12 ve významném množství syntetizuje Nocardiarugosa. Díky mutaci a selekci byl získán kmen N. rugosa, který akumuluje až 18 mg / l vitaminu B12. Producenty aktivních vitaminů se vyskytují u zástupců rodu Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae. Kobalaminsinteziruyuschey mají vysokou aktivitu methanogenních bakterií, například Methanosarcina barkeri, M. vacuolatai jednotlivým linií druhů halofilní druh Methanococcus halophilus [1, 4].Posledny tělo syntetizuje corrinoids více než 16 mg na gram biomasy. Takový vysoký obsah korrinoidů nebyl pozorován u žádného jiného studovaného mikroorganismu. Důvod pro vysoký obsah korrinoidů u methanogenních bakterií nebyl stanoven. Corrinoids syntetizují striktně anaerobní bakterie rodu clostridia. Clostridlum tetanomorphum a Cl. sticklandil adenosylkobalamin je součástí enzymových systémů, které katalyzují specifické izomerizační reakce aminokyselin, jako je glutamin, lysin a ornitin. Vitamín B se nachází ve významných množstvích.12 acetogenní clostridia Cl. termoacetikum, Cl. formicoaceticum a Acetobacter woodi, syntetizující acetát z CO2. Známí aktivní výrobci vitamínu B12 z Pseudomonas, mezi které jsou lepší než jiné, studoval druhu Pseudomonas denitrificans MB-2436 - mutant dávání optimalizovaný pro střední až 59 mg / l corrinoids. Zajímavé jsou termofilní bacily, konkrétně Bacillus circulans a vy. stearothermophilus, které rostou při 60 ° C a 75 ° C a 18 hodin kultivace bez pozorování sterilních podmínek, poskytují vysoký vitaminový výkon (2,0-6,0 mg / l). Corrinoids syntetizují Rhodopseudomonas palustris, fototrofní fialové bakterie Rhodobactersphericus, Rh. kapsulatus, Rhodospirillumrubrum, Chromatiumuinosum a řadu dalších druhů. Významné množství vitaminu B12 tvoří cyanobakterie Anabaena cylindrica, jednobuněčné zelené řasy Chlorella pyrenoidosae a červené řasy Rhodosorus marinus [1].

Nutriční média

Výrobci vitaminu B12 pěstované v prostředí připraveném na základě potravinových surovin: sójová mouka, rybí moučka, maso a kukuřičný extrakt. V posledních letech byly zjištěny mikroorganismy, které při likvidaci nepotravinářských surovin představují vysoké vlastnosti korinoků. Achromobactersp. S použitím isopropylalkoholu jako zdroje uhlíku a energie akumuluje až 1,1 mg / l provitaminu Pseudomonassp. syntetizuje vitamin b12 v médiu s methanolem nebo propandiolem (až do 160 μg / l) volitelně vytváří methylotrof až 2,6 mg / l vitaminu v médiu s methanolem. Kmen Klebsiella 101 byl izolován, čímž vznikl v buňkách velké množství korotinoidů, pouze když se pěstují na médiu s methanolem jako jediným zdrojem uhlíku a energie [1].

Biosyntéza vitaminu B12 [1]:

Produkce vitaminu B12

V naší zemi jako výrobce vitamínu B12 použijte Propionibacteriumf reudenreichii var. Shermanii [1,5]. Pro vitamín B12 bakterie se kultivují periodickou metodou v anaerobních podmínkách v prostředí obsahujícím kukuřičný extrakt, glukózu, kobaltové soli a síran amonný. Kyseliny vzniklé během fermentačního procesu se neutralizují roztokem alkalického kovu, který plynule vstupuje do fermentoru. Po 72 h ve středu dělá předchůdce - 5,6-DMB. Bez umělého podání 5,6-DMB, bakterie syntetizují faktor B a pseudovitamin B12 (adenin slouží jako dusíkatá báze) bez klinického významu. Fermentace je ukončena po 72 hodinách12 přetrvává v buňkách bakterií. Proto po ukončení fermentace se biomasa oddělí a z ní se extrahuje vitamín okyseleným na pH 4,5 až 5,0 při 85 až 90 ° C po dobu 60 minut s přídavkem 0,25% NaNO jako stabilizátoru.2. Při příjmu Ko-B12 stabilizátor není přidán. Vodný roztok vitaminu B12 ochlaďte, nastavte pH na 6,8-7,0 pomocí 50% roztoku NaOH. Do roztoku se přidá Al.2(SO4)318H2O a bezvodým FeCl3 koagulovat proteiny a filtrovat přes filtrační lis. Roztok se čistí na iontově výměnné pryskyřici SG-1, s níž se kobalaminy eluují roztokem amoniaku. Dále provedete další čištění vodného roztoku vitaminu organickými rozpouštědly, odpařením a čištěním na koloně s Al2O3. Z oxidu hlinitého se kobalaminy eluují vodným acetonem. Současně Ko-B12 mohou být odděleny od CN a oxykobalového min. Tím, směsi vody, acetonu vitamínu acetonu a udržuje se při 3-4 ° C po 24-48 hodin. Vysrážené krystaly vitamín odfiltruje, promyje suchým acetonem a diethyletherem a suší se ve vakuovém exsikátoru nad P2O5. Aby nedošlo k rozkladu Ko-B12 Všechny operace musí být prováděny ve velmi tmavých místnostech nebo v červeném světle. Tak je možné získat nejen směs CN a oxykobalaminů, ale také koenzymovou formu, která má vysoký terapeutický účinek. Pro chemické čištění vitaminu B12 je použita jeho schopnost tvořit produkty s fenolem a resorcinolem. Při této metodě se odděluje vitamin B12z jeho doprovodných faktorů je zjednodušeno. Průmyslový koncentrát kyanokobalaminu se zpracovává vodným roztokem resorcinolu (nebo fenolu), izoluje se komplex vitaminu B.12 s resorcinem (nebo fenolem), pak jej rozložte a získáte krystalický lék [1].

Použití vitamínu B12

Pro obohacení fermentovaných mléčných výrobků s vitamínem B12 propionové bakterie se používají jak v čisté formě, tak ve formě koncentrátu připraveného na syrovátku. Pro potřeby chovu zvířat vitamín B12 obdržíte pomocí směsné kultury obsahující termofilní bakterie tvořící metan [1,4]. Tvorba korrinoidů byla vytvořena nejen ve směsné, ale i v čisté metanové kultuře bakterií Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum, Mb. termoautotrophicum s růstem v přítomnosti H2 a CO2. Obsah korrinoidů v bakteriích tvořících metan je 1,0-6,5 mg / g suché biomasy. Při použití smíšené kultury bakterií vytvářejících metan byl vyvinut způsob získání přísady krmení vitamínem B.12-KMB12. Podkladem pro fermentaci metanu je aceton-butyl a alkohol bard. Aceton-butylbard se získá odstraněním rozpouštědel z kultivační tekutiny Clostridium acetobutylicum, která fermentuje pečivo a mouku. Pro fermentaci metanu se používá bard dekant, který obsahuje 2,0 až 2,5% sušiny. K dekantovanému bardu se přidá 4 g / m3 SOSI2 a 0,5% methanolu jako stimulantů syntézy kobalaminu. Močovina a fosforečnan diamonný se také používají jako biostimulanty, 5,6-DMB není přidáno, protože CN = B12a faktor III, které mají biologickou aktivitu, tvoří 80% součtu všech korrinoidů. Původní bard má teplotu asi 100 ° C a je prakticky sterilní. Před vstupem do fermentorů se bard ochladí na 55-57 ° C. Jako počáteční kultura se používá směsná kultura bakterií tvořících metan, provádějící termofilní "metanové fermentace" odpadních vod. Příjem koncentrátu vitaminu B12zahrnuje následující technologické stupně: kontinuální fermentace bard s komplexem bakterií, zesílení metanové kaše a sušení kondenzované hmoty na sprejové sušárně [1,4]. Fermentace probíhá v železobetonových fermentorech nepřetržitě po celý rok. Důležitou podmínkou normálního fermentačního procesu je kontrola úrovně mastných kyselin a amoniakálního dusíku. Vitamin B12 nestabilní během tepelného zpracování, zejména v alkalickém prostředí. Proto před odpařením se do methanové kaše přidá Cl k optimální hodnotě pH 5,0 až 5,3 a Na siřičitanu (optimální obsah je 0,07 až 0,1%). Před vstupem do odpařovací jednotky se metanová kaše odplyní zahřátím na 90-95 ° C při atmosférickém tlaku. Kaše se koncentruje na 20% suchých látek ve čtyřech tělních odparkách. Kondenzovaná metanová kaše se suší v rozprašovací sušárně.

Technologická schéma je uvedena na obrázku. Aceton-butylbard ze spodku kolonového sloupce vstupuje do sběrné baňky a je čerpán do dekantéru 3. Kaly z kalu se shromažďují v sběru 4 a používají se jako krmivo pro zvířata. Dekantát se ochladí na teplotu 55 až 57 ° C, chlorid kobaltnatý a methanol se přivádí do fermentoru 12. hmotnost klesla z horní části fermentoru je odstraněn a směrován do reaktoru 19, kde se provádí stabilizace vitamin B12přídavkem siřičitanu sodného a kyseliny chlorovodíkové ve směsi v mixéru 18. Z stabilizovaných mash odstraní plynů v plynové separátoru 22, rmut se zahustí v odpařovacím zařízení 24 a jsou shromažďovány ve sběrném 26. koagulované metanu kaše se čerpá 27 do sběrného metanu kaše 28, a odtud čerpadlo 29 k rozprašovací sušičce 31. Jako tepelný nosič pro sušení použijte fermentační plyny spálené v peci 39. Suchý prášek vstupuje do násypky 33 a je zabalen do plastových sáčků uzavřených v pytlích Kraft. Absence průmyslových odpadů, dostupnost surovin, kontinuita metody, která nevyžaduje sterilní podmínky, činí to ekonomickou [1].

Ukrajinský Výzkumný ústav alkoholických a likérových a vodárenských průmyslových odvětví vyvinul technologii pro získání koncentrátu vitaminu B12 fermentací melasy alkoholových bardů se smíšenou kulturou bakterií tvořících metan. Krmné kvasinky se předběžně pěstují na melasovém alkoholu bard. Po oddělení kvasinek se získá kultivační tekutina obsahující 7-8% pevných látek. Methanotvorné bakterie se na této kapalině pěstují a získá se 1,5-2 g vitaminu B z 1 m 3 původního bard12 [1].

  1. Průmyslová mikrobiologie: učebnice. manuál pro vysoké školy P 81 na specifikaci "Microbiology" a "Biology" / Z.A. Arkadieva, A.M. Bezborodov, I.N. Blokhin a DR.; Ed. Yegorova. - M.: Vyšší. school., 1989. - 688 stran, nemocný.
  2. N.A. Shmalko, I.I. Uvarova, Yu.F. Mules. Amarantová mouka - antioxidační přísada pro těstoviny, obohacená β - karotenem // Potravinářská technologie. - 2004 - № 5-6. - str. 39-41.
  3. K.K. Polyansky, L.V. Golubeva, O.I. Dol Matova, D.V. Dorokhin. Studium reologických vlastností konzervovaných mléčných druhů s β - karotenem // Potravinářská technologie. - 2001 - №1. - str. 28-29.
  4. Niktin G.A. Biochemický základ mikrobiologické produkce: Proc. příspěvek. - Kyjev: škola Vishcha. Hlavní vydavatelství, 1981. - 312 p.
  5. Elinov N.P. Základy biotechnologie. Vydavatelská firma "Science" SPB 1995. 600 p. 166 nemoc.
  6. Golubev V.N., Zhiganov I.N. Potravinářská biotechnologie. - M.: DeLi print, 2001. - 123 s.

Přečtěte si také články o produkci vitamínů:

Autor článku a fotografie v článku: Lyapustina EV

Přečtěte Si Více O Výhodách Produktů

Co vitamíny v brusinkách dělají to nepostradatelné

Stále zelená rostlina, která rostou v bažinách, se obyčejně nazývá "jarní tráva" nebo "jeřáb". Ale při jednání o všem je to "brusinka". Jaké vitamíny v brusinkách jsou považovány za nejcennější a jaké léčebné vlastnosti má červené bobule, podívejme se na to v pořádku.

Čtěte Více

Rodinné stránky

Dokonce i ty nejdražší věci nejsou schopny změnit obraz stejně jako nějaké detaily: ať už je to květina ve vlasech, opasek, opasek, brož, vlásenka nebo neobvyklý tvar manžety na halenku.

Čtěte Více

Jak je vařený úzký list (Ivan-čaj) užitečný pro muže a ženy?

Černý listnatý kyperskýVíceletá bylinná rostlina. Je oceněna protizánětlivým, protinádorovým, hojením rány, absorbujícím, protiedémovým, sedativním účinkem.

Čtěte Více